本发明公开了一种猫人参提取物,其总皂苷的质量百分含量为40%~75%,有效成分主要包括科罗索酸、2α,3β,24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸、2α,3α,24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸和2α,3α,19α,24-四羟基乌苏烷-12-烯-28-酸。本发明还提供了该猫人参提取物的制备方法,该制备方法包括提取、脱色剂除杂脱色、葡聚糖凝胶纯化等工序。经药理实验表明,本发明猫人参提取物具有较好的抗肿瘤作用,因而可将其用于制备抗肿瘤的药物。
1.一种猫人参提取物,其特征在于:该提取物中总皂苷的含量为40%~75%;有效成分包括科罗索酸、2α,3β,24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸、2α,3α,24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸和2α,3α,19α,24-四羟基乌苏烷-12-烯-28-酸;前述猫人参提取物的制备方法,包括如下步骤:(1)药材提取:将干燥、粉碎的猫人参药材以体积浓度为50%~95%乙醇或甲醇水溶液进行渗漉提取或回流提取,提取液浓缩至无醇味,放冷,离心,分取沉淀;回流提取条件为:温度50~80°C,料液重量比:1:30~1:60,乙醇或甲醇体积浓度为50%~95%;(2)除杂脱色:将步骤(1)制得的沉淀以体积浓度为50%~100%乙醇或甲醇水溶液溶解,加入脱色剂除杂脱色,脱色液浓缩,得除杂脱色后产物;所用脱色剂为活性碳,或活性白土,或者活性碳和活性白土的混合物;(3)分离纯化:将步骤(2)制得的除杂脱色后产物用体积浓度为50%~95%乙醇或甲醇水溶液溶解,上Sephadexxa0LH-20葡聚糖凝胶柱,先用体积浓度为5%~25%乙醇或甲醇水溶液洗脱至近无色,再用体积浓度为70%~100%乙醇或甲醇水溶液洗脱皂苷类成分,收集洗脱液,浓缩,干燥,粉碎,即得总皂苷质量百分含量为60%~75%提取物。
2.根据权利要求1所述的猫人参提取物,其特征在于,步骤(2)所用的脱色剂为活性炭和与活性白土之比为10:1~1:20(重量比)的混合脱色剂,用量为药材量的25%~200%。
3.根据权利要求2所述的猫人参提取物,其特征在于步骤(3)所用的脱色剂为活性炭与与活性白土之比为1:10(重量比)的混合脱色剂,用量为药材量的50%。
4.权利要求1-3中任何一项所述的猫人参提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。技术领域
本发明涉及一种中药猫人参提取物,以及该猫人参提取物的制备方法和医药用途。
背景技术
目前,包括肝癌在内的恶性肿瘤作为常见病、多发病,严重危害人类的健康。世界卫生组织(WHO)和美国临床肿瘤学会(ASCO)统计数据表明,1990年全世界肿瘤所致死亡数占总死亡数的12.3%,预计2015年将达到14.6%。据美国国立癌症研究院(Nationalxa0Cancerxa0Institute)数据:1998~2002年恶性肿瘤发病率为469.7/10万,家庭、国家及社会为此付出的代价沉重。在恶性肿瘤的多种治疗方法中,化疗在临床上发挥着重要的作用。目前,从中药、天然药物中开发抗肿瘤药物已经成为抗肿瘤药物研发的重要方向。中药猫人参为猕猴桃科植物对萼猕猴桃(Actinidiaxa0valvataxa0Dunn)的根和老茎,主要分布于浙江、江西、江苏等华东地区,临床用于治疗恶性肿瘤,为华东地区常用抗肿瘤中药。目前,仅见少量关于猫人参化学成分、药理作用方面的研究报道[张亚妮,刘岭,凌昌全.猫人参有效部位对小鼠移植性肿瘤H22的抑制作用及机制探讨.中国中药杂志,2006,36(11):918-920;陆胤,陈绍瑗,吴平,等.药用植物猫人参有效成分研究(I)-无机元素分析.浙江大学学报,2004,30(2):185-188;辛海量,吴迎春,徐燕丰,等.对萼猕猴桃根与茎的比较研究.第二军医大学学报,2008,29(3):298-302]。目前,未见有葡聚糖凝胶柱色谱技术用于制备总皂苷含量高的猫人参提取物的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种总皂苷含量高的猫人参提取物,并提出其制备方法和医药用途。对于中药提取物的制备而言,简便、快速、高效的脱色、除杂、纯化方法至关重要,也是中药提取物制备工艺中的瓶颈问题。本发明人长期从事中药化学、制备工艺以及抗肿瘤中药新药等方面的研究工作,在猫人参提取物的制备过程中,曾尝试采用多种除杂脱色工艺路线,结果表明不仅工艺步骤繁琐,而且效果也不尽理想。最终经反复筛选优化,采用活性炭和活性白土混合脱色剂对粗提物进行除杂脱色,再用葡聚糖凝胶色谱对脱色后产物进行纯化,取得了很好的效果,非常便于生产应用。本发明猫人参提取物的有效组分主要为三萜皂苷类成分,包括科罗索酸、2α,3β,24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸、2α,3α,24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸和2α,3α,19α,24-四羟基乌苏烷-12-烯-28-酸等,总皂苷占提取物的质量百分含量为40%~75%。本发明提供的猫人参提取物的制备方法,主要包括药材提取、除杂脱色、分离纯化工序,具体说明如下:(1)药材提取:将干燥、粉碎后的中药猫人参药材,以体积浓度为50%~95%乙醇或甲醇水溶液,用回流或渗漉方法进行提取,提取液合并,回收浓缩至无醇味,得浓缩液;将上述浓缩液放冷,离心,分取沉淀;本步骤还可选用体积浓度为70%~95%乙醇或甲醇水溶液进行,优选体积浓度为80%乙醇或甲醇水溶液。考虑到可能的有机溶剂残留、生产中的安全因素以及成本因素,乙醇水溶液为首选。(2)除杂脱色:将步骤(1)制得的沉淀以体积浓度为50%~100%乙醇或甲醇水溶液溶解,加入脱色剂除杂脱色,脱色液浓缩至近干,得除杂脱色后产物。本步骤溶解沉淀还可选用体积浓度为70%~100%乙醇或甲醇水溶液,优选体积浓度为100%乙醇或甲醇水溶液。本步骤脱色剂可选用活性碳,或活性白土,或两者的混合物。优选活性炭与活性白土之比为10∶1~1∶20(重量比)的混合脱色剂,最优选活性炭与活性白土之比为1∶10(重量比)的混合脱色剂。本步骤脱色剂的用量:脱色剂与药材重量比为25%~200%,优选25%~100%,最优选50%。(3)分离纯化:将(2)中制得的除杂脱色后产物用体积浓度为50%~95%乙醇或甲醇水溶液溶解,上葡聚糖凝胶色谱柱,先用体积浓度为5%~25%乙醇或甲醇水溶液洗脱至近无色,再用体积浓度为70%~100%乙醇或甲醇水溶液洗脱皂苷类成分,收集洗脱液,浓缩,干燥,粉碎,即得猫人参提取物。本步骤溶解除杂脱色后产物还可选用体积浓度为70%~95%乙醇或甲醇水溶液,优选体积浓度为80%乙醇或甲醇水溶液。本步骤优选Sephadexxa0LH-20葡聚糖凝胶色谱柱进行分离纯化,先选用体积浓度为10%~25%乙醇或甲醇水溶液洗脱至近无色,优选20%乙醇或甲醇水溶液;选用体积浓度为70%~100%乙醇或甲醇水溶液洗脱皂苷类成分,优选100%乙醇或甲醇。考虑到可能的有机溶剂残留、生产中的安全因素以及成本因素,乙醇水溶液为首选。本步骤应用葡聚糖凝胶脱色对于猫人参提取物的制备至关重要,若不采用葡聚糖凝胶纯化,尽管提取物的得率得以提高,但是提取物的总皂苷含量将会大大降低,以至于总皂苷含量降低到50%以下,大大降低了提取物的品质(详见实施例7),根据SFDA颁布的《药品注册管理办法》,总皂苷含量降低到50%以下时,就不能作为有效部位申报新药。这正是本发明提取物制备工艺中采用葡聚糖凝胶纯化步骤的创造性意义。本发明采用紫外-可见分光光度法对猫人参提取物的总皂苷含量进行测定,提取物中单体成分的鉴定采用¹HNMR、¹³CNMR进行分析,根据所得数据进行结构确认。随后的实施例将证明,采用本发明前述制备工艺,最终可得到总皂苷质量百分含量为60%~75%的猫人参提取物,其有效组分主要为三萜皂苷类成分,主要包括科罗索酸、2α,3β,24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸、2α,3α,24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸和2α,3α,19α,24-四羟基乌苏烷-12-烯-28-酸等。本发明猫人参提取物的制备方法具有工艺简便,成本低廉,安全有效,无有机溶剂残留等优点,经药理实验证明具有较强的抗肿瘤作用,因而可用于制备抗肿瘤药物。鉴于现代社会中恶性肿瘤发病率的急剧上升,从中药、天然药物中开发抗肿瘤药物已经成为抗肿瘤新药研发的重要方向,本发明提取物具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为猫人参提取物的高效液相色谱(HPLC)图。图2为猫人参提取物的体外抗肿瘤实验量效关系曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例,进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。本发明以下实施例中,乙醇、甲醇的浓度均为体积浓度。实施例1(制备猫人参提取物)猫人参药材粗粉1kg,以80%乙醇水溶液,10倍、8倍、8倍,2小时、1.5小时、1.5小时,回流提取,提取液趁热过滤,合并提取液,减压回收溶剂至无醇味,蒸馏水调节浓度为1g(生药)/ml,5000rpm,离心15分钟,分取沉淀,以适量无水乙醇溶解,补加至10000ml。加入混合脱色剂(活性炭∶活性白土=1∶10)500g除杂脱色,加热至70°C,保持恒温1小时,滤过,滤过液减压浓缩至近干,用80%乙醇溶解样品,每次取40ml上Sephadexxa0LH-20葡聚糖凝胶柱,20%乙醇水溶液洗脱至近无色,用100%乙醇水溶液洗脱,收集洗脱液,减压浓缩,干燥,粉碎,得提取物6.43g,外观极淡黄色。按照参考文献(何正有,张艺,张旭,等.分光光度法测定藏药翼首草中总皂苷的含量.华西药学杂志,2002,17(1):43-45)方法进行总皂苷含量测定,提取物总皂苷含量以熊果酸计74.05%。对提取物进行HPLC分析,HPLC色谱图见图1。分析条件:岛沣LC-20AD高效液相色谱仪(四元低压梯度洗脱系统,ELSD检测器),色谱柱:Shim-packCLC-ODS色谱柱(4.6mm×25mm,5μm);保护柱:DIKMAxa0Easyxa0Guardxa0C18(10mm×4.6mm),流动相:A:乙腈,B:0.5%醋酸水溶液,梯度洗脱:0~60min,流动相A:45%~60%。流速:1.0ml/min,柱温:25°C。经与对照品比对,采用¹HNMR、¹³CNMR进行鉴定,色谱图中色谱峰1,4,6,7代表的化合物分别为2α,3α,19α,24-四羟基乌苏烷-12-烯-28-酸,2α,3α,24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸,2α,3β,24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸以及科罗索酸。实施例2(制备猫人参提取物)猫人参药材粗粉1kg,以95%乙醇水溶液作为提取溶剂,其余同实施例1,得提取物5.12g,产品外观淡黄色,总皂苷含量以熊果酸计66.80%。实施例3(制备猫人参提取物)猫人参药材粗粉1kg,以60%乙醇水溶液作为提取溶剂,其余同实施例1,得提取物4.23g,产品外观淡黄色,总皂苷含量以熊果酸计51.52%。实施例4(制备猫人参提取物)猫人参药材粗粉1kg,混合脱色剂用量2000g(活性炭∶活性白土=1∶10),其余同实施例1,得提取物2.90g,产品外观淡黄色,总皂苷含量以熊果酸计40.22%。实施例5(制备猫人参提取物)猫人参药材粗粉1kg,混合脱色剂用量1000g(活性炭∶活性白土=1∶5),其余同实施例1,得提取物3.48g,产品外观淡黄色,总皂苷含量以熊果酸计48.90%。实施例6(制备猫人参提取物)猫人参药材粗粉1kg,在葡聚糖凝胶纯化步骤,用20%甲醇水溶液洗脱至近无色,再80%甲醇洗脱皂苷成分,其余同实施例1,得提取物4.24g,产品外观淡黄色,总皂苷含量以熊果酸计61.35%。实施例7(制备猫人参提取物)猫人参药材粗粉1kg,脱色后不经葡聚糖凝胶纯化,直接干燥粉碎,其余同实施例1,得提取物10.36g,产品外观褐色,总皂苷含量以熊果酸计40.54%。实施例8(制备猫人参提取物)猫人参药材粗粉1kg,仅选用50g活性炭作为脱色剂脱色,其余同实施例1,得提取物7.12g,产品外黄色,总皂苷含量以熊果酸计43.79%。实施例9(猫人参提取物的药效实验)1.体外抗肿瘤实验(MTT测试)取对数生长期的HL60、Hep3B、HepG2肿瘤细胞(由中国科学院上海细胞研究所引进),用含10%小牛血清的RPMIxa01640培养基分别配成7×10⁴、1.05×10⁵个/ml的细胞悬液,分别接种在96孔培养板中,每孔接种90μl;分别加入含不同浓度提取物(实施例1方法制备)的PBS溶液10μl,使终浓度分别为50、100、200、300、400、500μg/ml,空白对照组加10μlxa0RPMIxa01640培养基,每组设5个平行孔,37°C,5%CO₂培养3d;每孔加5mg/mlxa0MTT生理盐水溶液10μl,37°C继续培养4h;96孔板800g离心10min,弃去上清,每孔加DMSOxa0150μl,振荡混匀,在酶标仪上以492nm波长测定光密度值。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率:肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1-实验组OD/对照组OD值)×100以浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图得量效关系曲线(图2),结果表明提取物具有较强的细胞毒作用。2、体内抗肿瘤实验小鼠肝癌细胞系H22(由中国科学院上海细胞研究所引进)复苏传代培养,收集对数期细胞,用生理盐水调整至1×10⁶个/ml,以每只0.5ml接种于小鼠腹腔中,一周后抽取小鼠腹水,用生理盐水按照1∶4稀释成细胞悬液,以0.2ml/只接种于小鼠(昆明种小鼠由复旦大学实验动物中心提供)右前肢腋部皮下。在接种24h后,小鼠完全随机分组。空白对照组灌胃给予等体积空白溶剂;提取物低剂量组、中剂量组、高剂量组(实施例1方法制备)灌胃给药,剂量见表1,连续14天;CTX组(环磷酰胺,上海华联制药有限公司):腹腔注射CTXxa030mg/kg,隔日一次,连用4次。所有各组给药容积均为0.2ml/只。末次给药后次日,采用颈椎脱臼法处死小鼠,剥离瘤块称重,按照以下公式计算肿瘤生长抑制率:肿瘤生长抑制率(%)=(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100结果表明给予提取物低、中、高剂量均能抑制肿瘤的生长(表1),表明提取物具有较强的抗肿瘤效果。表1.猫人参提取物对小鼠移植瘤的抑制作用ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="700"/>注:与对照组比较^*P<0.01实施例10(猫人参提取物的急性毒性实验)按最大给药容量、最大药物溶解浓度,给ICR小鼠单次灌胃给予猫人参提取物(实施例1方法制备)3.0g/kg体重,给ICR小鼠单次腹腔注射给予猫人参提取物2.4g/kg体重,观察给药后动物14天内的毒性反应及死亡情况。结果小鼠单次灌胃给药,4小时内小鼠未见异常,给药后14天内,小鼠未出现死亡,第15天,全部小鼠处死,解剖,肉眼检查各脏器,均未见明显病变;小鼠腹腔注射给药,20分钟后,4只小鼠出现精神萎靡、蜷缩,活动减少,给药2小时后,全部小鼠恢复正常,给药后14天内,小鼠未出现死亡,第15天,全部小鼠处死,解剖,肉眼检查各脏器,均未见明显病变,表明猫人参提取物的毒性低。